Острозька Біблія з'явилася у час активної видавничої діяльності, коли представники різних конфесій вперше друкували власні версії Біблії різними європейськими мовами. На противагу протестантським переклададам Біблії періоду Реформації, католицька церква розпочала друк власних перекладів Біблії у рамках Контрреформації. Видавець зібрав церковнослов'янські та грецькі списки з монастирів усього православного Сходу. Зокрема Діонісій Раллі Палеолог за вказівкою папи Григорія XIII близько 1578–1579 рр. привіз з Рима до Острога список Біблії. Із Москви було привезено копію повної рукописної Геннадіївської Біблії (1499). Зібрані списки звіряли з грецькою Септуаґінтою, редагували або наново перекладали. На відміну від Геннадієвської Біблії, у видання не включили коментарі, передмови та додаткові статті католицьких схоластів. Текст О.Б. готувався до друку, звірявся та узгоджувався за різними списками, редагувався та доповнювався членами острозького літературно-видавничого осередку впродовж декількох років. При цьому використовувалися не тільки церковнослов'янські, а й грецькі, латинські, єврейські джерела та західноєвропейські видання біблійного тексту. Через те, що друкування О.Б. не було завершене в намічений термін, є варіанти видання з післямовами 1580 р. та 1581 р. О.Б. містить, окрім канонічного біблійного тексту, передмову від імені Костянтина Острозького, ще одну передмову й два вірші ректора Острозької академії Герасима Смотрицького та коротку післямову Івана Федорова. Деякі екзепляри Острозької Біблії невдовзі після її друку опинилися у Західній Європі. Так, князь Костянтин-Василь Острозький подарував один примірник Папі Римському Григорію XIII. Московський цар Іван Грозний подарував екземпляр англійському послу Джерому Горсею. Відомий примірник, що належав шведському королю Густаву II Адольфу.
